動(dòng)物飼料蛋白檢測(cè)

 GB／T 6432—94

　　本標(biāo)準(zhǔn)參照采用ISO 5983—1979 《動(dòng)物飼料──氮含量的測(cè)定和粗蛋白含量計(jì)算》。

1 主題內(nèi)容與適用范圍

　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中粗蛋白含量的測(cè)定方法。

　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料和單一飼料。

2 引用標(biāo)準(zhǔn)

　　GB 601 化學(xué)試劑滴定分析（容量分析）用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

3 原理

　　凱氏法測(cè)定試樣中的含氮量，即在催化劑作用下，用硫酸破壞有機(jī)物，使含氮物轉(zhuǎn)化成硫酸銨。加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，測(cè)出氮含量，將結(jié)果乘以換算系數(shù)6.25，計(jì)算出粗蛋白含量。

4 試劑

4.1 硫酸（GB 625）：化學(xué)純，含量為98％，無(wú)氮。

4.2 混合催化劑：0.4g硫酸銅，5個(gè)結(jié)晶水（GB 665），6g硫酸鉀（HG 3─920）或硫酸鈉（HG 3─908），均為化學(xué)純，磨碎混勻。

4.3 氫氧化鈉（GB 629）：化學(xué)純，40％水溶液（m／V）。

4.4 硼酸（GB 628）：化學(xué)純，2％水溶液（m／V）。

4.5 混合指示劑：甲基紅（HG 3─958）0.1％乙醇溶液，溴甲酚綠（HG 3─1220）0.5％乙醇溶液，兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為三個(gè)月。

4.6 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：鄰苯二甲酸氫鉀法標(biāo)定，按GB 601制備。

4.6.1 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：c（HCl）＝0.1mol／L。8.3mL鹽酸（GB 622，分析純），注入 1000mL蒸餾水中。

4.6.2 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：c（HCl）＝0.02mol／L。1.67mL鹽酸（GB 622，分析純），注入1000mL蒸餾水中。

4.7 蔗糖（HG 3─1001）：分析純。

4.8 硫酸銨（GB 1396）：分析純，干燥。

4.9 硼酸吸收液：1％硼酸水溶液1000mL，加入0.1％溴甲酚綠乙醇溶液10mL，0.1％甲基紅乙醇溶液7mL，
4％氫氧化鈉水溶液0.5mL，混合，置陰涼處保存期為一個(gè)月（全自動(dòng)程序用）。

5 儀器設(shè)備

5.1 實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或研缽。

5.2 分樣篩：孔徑0.45mm（40目）。

5.3 分析天平：感量0.0001g。

5.4 消煮爐或電爐。

5.5 滴定管：酸式，10、25mL。

5.6 凱氏燒瓶：250mL。

5.7 凱氏蒸餾裝置：常量直接蒸餾式或半微量水蒸氣蒸餾式。

5.8 錐形瓶：150、250mL。

5.9 容量瓶：100mL。

5.10 消煮管：250mL。

5.11 定氮儀：以凱氏原理制造的各類(lèi)型半自動(dòng)，全自動(dòng)蛋白質(zhì)測(cè)定儀。

6 試樣的選取和制備

　　選取具有代表性的試樣用四分法縮減至200g，粉碎后全部通過(guò)40目篩，裝于密封容器中，防止試樣成分的變化。

7 分析步驟

7.1 仲裁法

7.1.1 試樣的消煮

　　稱(chēng)取試樣0.5～1g（含氮量5～80mg）準(zhǔn)確至0.0002g，放入凱氏燒瓶（5.6）中，加入6.4g混合催化劑（4.2），與試樣混合均勻，再加入12mL硫酸（4.1）和2粒玻璃珠，將凱氏燒瓶（5.6）置于電爐（5.4）上加熱，開(kāi)始小火，待樣品焦化，泡沫消失后，再加強(qiáng)火力（360～410℃）直至呈透明的藍(lán)綠色，然后再繼續(xù)加熱，至少2h。

7.1.2 氨的蒸餾（蒸餾步驟的檢驗(yàn)見(jiàn)附錄A）

7.1.2.1 常量蒸餾法

　　將試樣消煮液（7.1.1）冷卻，加入60～100mL蒸餾水，搖勻，冷卻。將蒸餾裝置（5.7）的冷凝管末端浸入裝有25mL硼酸（4.4）吸收液和2滴混合指示劑（4.5）的錐形瓶?jī)?nèi)。然后小心地向凱氏燒瓶（5.6）中加入50mL氫氧化鈉溶液（4.3），輕輕搖動(dòng)凱氏 燒瓶（5.6），使溶液混勻后再加熱蒸餾，直至流出液體積為100mL。降下錐形瓶，使冷凝管末端離開(kāi)液面，繼續(xù)蒸餾1～2min，并用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐形瓶?jī)?nèi)，然后停止蒸餾。

7.1.2.2 半微量蒸餾法

　　將試樣消煮液（7.1.1）冷卻，加入20mL蒸餾水，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，做為試樣分解液。將半微量蒸餾裝置（5.7） 的冷凝管末端浸入裝有20mL硼酸（4.4）吸收液和2滴混合指示劑（4.5）的錐形瓶（5.8）內(nèi)。蒸汽發(fā)生器 （5.7）的水中應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，硫酸數(shù)滴，在蒸餾過(guò)程中保持此液為橙紅色，否則需補(bǔ)加硫酸。準(zhǔn)確移取試樣分解液10～20mL注入蒸餾裝置（5.7）的反應(yīng)室中，用少量蒸餾水沖洗進(jìn)樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氫氧化鈉溶液（4.3），小心提起 玻璃塞使之流入反應(yīng)室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4min降下錐形瓶（5.8）使冷凝管末端離開(kāi)吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶?jī)?nèi)，然后停止蒸餾。

　　注：7.1.2.1和7.1.2.2蒸餾法測(cè)定結(jié)果相近，可任選一種。

7.1.2.3 蒸餾步驟的檢驗(yàn)

　　稱(chēng)取0.2g硫酸銨（4.8），代替試樣，按7.1.2或7.2.2步驟進(jìn)行操作，測(cè)得硫酸銨含氮量為21.19±0.2％，否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。 

7.1.3 滴定

　　用7.1.2.1或7.1.2.2法蒸餾后的吸收液立即用0.1mol／L（ 4. 6. 1）或0 .02mol／L（4.6.2）鹽酸標(biāo)

　　準(zhǔn)溶液滴定，溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。

7.2 推薦法

7.2.1 試樣的消煮

　　稱(chēng)取0.5～1g試樣（含氮量5～80mg）準(zhǔn)確至0.0002g，放入消化管中，加2片消化片（儀器自備）或
6.4g混合催化劑（4.2），12mL硫酸（4.1），于420℃下在消煮爐上 消化1h。取出放涼后加入30mL蒸餾水。

7.2.2 氨的蒸餾

　　采用全自動(dòng)定氮儀（5.11）時(shí)，按儀器本身常量程序進(jìn)行測(cè)定。

　　采用半自動(dòng)定氮儀（5.11）時(shí)，將帶消化液的管子插在蒸餾裝置上，以25mL硼酸（4.4）為吸收液，加入2滴混合指示劑（4.5），蒸餾裝置（5.7）的冷凝管末端要浸入裝有吸收液的錐形瓶?jī)?nèi)，然后向消煮管中加入50mL氫氧化鈉溶液（4.3）進(jìn)行蒸餾。蒸 餾時(shí)間以吸收液體積達(dá)到100mL時(shí)為宜。降下錐形瓶，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐形瓶?jī)?nèi)。

7.2.3 滴定

　　用0.1mol／L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液（4.6.1）滴定吸收液，溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。

8 空白測(cè)定

　　稱(chēng)取蔗糖0.5g，代替試樣，按第7章進(jìn)行空白測(cè)定，消耗0.1mol／L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.6.1）的體積不得超過(guò)0.2mL。消耗0.02mol／L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.6.2）體積不得超過(guò)0.3mL。

9 分析結(jié)果的表述

9.1 計(jì)算見(jiàn)下式：

9.2 重復(fù)性

　　每個(gè)試樣取兩個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定，以其算術(shù)平均值為結(jié)果。

　　當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在25％以上時(shí)，允許相對(duì)偏差為1％。

　　當(dāng)粗蛋白含量在10％～25％之間時(shí)，允許相對(duì)偏差為2％。

　　當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在10％以下時(shí)，允許相對(duì)偏差為3％。